前言

HCP ELISA检测方法必须要通过法规认可的实验方法（ICH或FDA指南等）进行方法学验证，以确保其能够产生准确的结果。想要获得准确的HCP ELISA检测结果，本质上是要保证样品中HCP的浓度高于试剂盒的定量下限（LOQ），同时HCP的检测抗体还要处于过剩状态，满足这两点就必须要对检测样品（过程样品和最终的药物原液）进行稀释线性验证。因此，稀释线性（dilution linearity）是验证HCP ELISA方法特异性和准确性的关键实验之一。在HCP检测中，稀释线性不佳的原因主要有两种：一种是样品中某些HCPs的抗体过剩条件不满足，需要通过进一步稀释来达到“最小必要稀释倍数”（MRD）；另一种是产品蛋白本身或产品配方缓冲液中的某些成分对HCP的检测产生干扰，可以采用指定的样品稀释液（见文末）或者缓冲液置换等方式处理样品来满足检测需求。关于样品稀释液，最优的选择是使用和标准品相同的稀释液。Cygnus针对每种ELISA检测方法都提供了相应的样品稀释液，以确保检测结果的准确性和可重复性。对于使用Cygnus HCP ELISA试剂盒的用户，我们建议将可接受的稀释线性定义为“在两倍稀释时，校正后的HCP浓度变化不超过±20%”。同时，还要避免检测值靠近定量下限，即稀释样品HCP检测值不能低于定量下限的两倍。接下来，本文将为您详细解读HCP ELISA方法学验证中有关线性稀释的操作方法与注意事项。

为什么要建立稀释线性？

在测试一个新的宿主细胞蛋白（HCP）ELISA方法时，建立稀释线性是第一项基础实验，目的是确认所选择的HCP ELISA是否适用于您的过程样品和药物原液中的HCPs。当稀释线性确认后，它将为进一步的分析验证提供所需的实验条件信息，因此稀释线性通常是最先进行的验证实验。

具体来讲，稀释线性实验的目的是确定ELISA方法对样品中HCPs的反应曲线和全定量范围。成功验证了稀释线性意味着对存在于该样品中的各种HCPs，抗体过剩条件已满足，且样品基质不会影响HCP的定量，从而保证HCP ELISA检测结果的可靠性。

如何进行稀释线性实验？

在进行ELISA分析之前，任何可能超过定量上限（ULOQ）的样品都应该先进行稀释线性实验。其过程包括：用验证过的样品稀释液对HCP待检样品进行多个梯度稀释，然后对这些稀释样品进行检测，并计算每个稀释样品中校正后的HCP浓度（即测得的HCP浓度×稀释倍数）。大多数情况下，在达到一定稀释倍数后，稀释样品校正后的HCP浓度值会出现相对恒定状态，那么该稀释倍数则被称为“最低需求稀释度”（MRD）。

图1 最低需求稀释度（MRD）

如下表案例，样品在高浓度（未稀释和1:2，1:4稀释）时并未显示出良好的稀释线性，但随着进一步稀释，我们可以确定一个MRD，即在此稀释度实现了可接受的稀释线性（见下表蓝色行）。按照定义，当校正后的HCP浓度在2倍稀释之间的变化范围不超过±20%时，即达到了可接受的稀释线性，同时还要避免靠近定量下限，即稀释样品HCP检测值不能低于定量下限的两倍（在这个案例中1:64稀释样品HCP检测值＜2倍LOQ，因此未计入统计）。变化百分比可以通过减去前一稀释样品浓度的校正值，然后将差值再除以前一个稀释样品浓度的校正值来计算。例如，1:2稀释样品相较未稀释样品的变化百分比为：[(233-146)/146]x100%=60%。

从表中数据我们可以得出结论，该样品的MRD为1:4，那么最终计算出HCP的浓度应在MRD以下（或等于）和LOQ以上所有校正后HCP浓度的平均值（在此例中，应取312、361、356和370的平均值即350ng/mL）。

在实际应用中，我们应当对需要检测HCP的所有样品类型（包括过程样品以及最终的药物原液）进行稀释线性的评估，并将每种样品类型和基质的MRD值以及稀释不同样品的具体指导纳入到SOP文件中。

稀释线性不佳的原因与解决方法

对于HCP ELISA检测，可能会出现某些HCPs稀释线性不佳的情况，也就是样品中存在某些HCPs的抗体过剩条件未被满足。例如，个别高浓度的HCP可能对该特定HCP的抗体产生饱和，出现了“钩子效应（high-dose hook effect）”，从而导致该HCP的定量不准确。

图2 钩子效应（high-dose hook effect）示意图

此外，某些伴随蛋白（hitchhiker proteins）可能会与产物蛋白相互作用，并在纯化过程中显著富集，从而完全干扰整个分析的线性。

图3. 伴随蛋白（hitchhiker proteins）与产物蛋白相互作用干扰分析线性

其他导致稀释线性不佳的原因还有可能是产品配方（或过程样品的缓冲溶液）中的某些成分干扰了检测，对于Cygnus HCP ELISA试剂盒，已知的干扰因素包括极端pH、洗涤剂、有机溶剂、高蛋白浓度和高盐浓度等，因此我们建议样品的稀释一定要使用和标准品相同的稀释液，详见下表。

Cygnus不同生物工艺杂质检测试剂盒对应的样品稀释液一览

最后，我们再次强调，只有在抗体过剩的情况下，剂量反应曲线才会呈正斜率，检测结果才是准确的。

如果稀释线性不佳的因素是由HCP抗体不足或样品基质干扰，那么随着样品的稀释倍数增加，其测得的HCP浓度会呈现上升趋势，因此需要通过进一步稀释样品来达到MRD。如果是其他原因，也可以通过优化实验步骤来提高检测的准确性。如果增加样品的稀释倍数仍无法解决稀释线性不佳的问题，则有可能是纯化过程存在问题。

Cygnus针对每一种检测试剂盒均提供相应的QS（Qualification Summary）文件，如有需求欢迎点击这里填写信息索取，或者联系Cygnus中国总代理太阳集团tcy8722。如果您在Cygnus HCP ELISA试剂盒的使用中遇到了稀释线性相关问题且无法通过上述方法解决的，也欢迎您随时联系太阳集团tcy8722，我们的技术支持会针对您的问题提供相应解决方法和建议。接下来我们还会陆续分享一系列关于HCP ELISA方法学验证的内容，包括加标回收以及HCP抗体适用性验证等，敬请关注。

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